SPOS技術(shù)：血細(xì)胞應(yīng)用

簡(jiǎn)介：Accusizer780測(cè)試紅細(xì)胞和白細(xì)胞的粒徑分布和顆粒計(jì)數(shù)

傳統(tǒng)上，紅細(xì)胞和白細(xì)胞的計(jì)數(shù)分布都是通過(guò)電阻法測(cè)試的。粒子分散在導(dǎo)電介質(zhì)中，當(dāng)粒子通過(guò)一個(gè)小孔時(shí)會(huì)導(dǎo)致電阻的增加、電導(dǎo)率的下降，電阻的響應(yīng)值與粒子大小和體積有關(guān)。雖然這項(xiàng)技術(shù)多年來(lái)應(yīng)用良好，但本文可證明，使用SPOS（單粒子光學(xué)傳感技術(shù)）結(jié)合自動(dòng)稀釋的顆粒計(jì)數(shù)器可更容易地確定紅細(xì)胞和白細(xì)胞的粒徑大小，與電阻法相比，可用的稀釋劑種類(lèi)更多，限制更小。

Accusizer780采用光阻法，單粒子光學(xué)傳感技術(shù)(SPOS)的原理，可同時(shí)測(cè)試粒徑分布和顆粒計(jì)數(shù)。傳感器內(nèi)部有一個(gè)激光，單個(gè)粒子在經(jīng)過(guò)光感區(qū)域時(shí)，對(duì)激光造成遮擋，從而導(dǎo)致光強(qiáng)度下降，光強(qiáng)的減弱與粒子的橫截面積成比例。Accusizer780配置有自動(dòng)稀釋模塊，當(dāng)樣品濃度過(guò)高，導(dǎo)致多個(gè)粒子可能同時(shí)通過(guò)傳感器感應(yīng)區(qū)域(這個(gè)概率與顆粒濃度有關(guān))，此時(shí)樣品會(huì)被自動(dòng)稀釋。儀器可允許稀釋后的樣品在短時(shí)間間隔內(nèi)同時(shí)計(jì)數(shù)粒子（500,000#/min），而避免粒子間的重合效應(yīng)，這意味著粒子間不會(huì)相互遮擋，一次計(jì)數(shù)一個(gè)粒子，得到真實(shí)的粒度分布和統(tǒng)計(jì)精度。這其中僅需一條校準(zhǔn)曲線(xiàn)即可將脈沖電壓轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的粒徑，不需要復(fù)雜的數(shù)學(xué)算法。由于儀器具有自動(dòng)稀釋的能力，且一次計(jì)數(shù)一個(gè)粒子，因此可確定所有經(jīng)過(guò)傳感器的粒子都會(huì)被統(tǒng)計(jì)在內(nèi)，且不會(huì)造成重復(fù)計(jì)數(shù)。這種測(cè)試方式?jīng)Q定了儀器在粒徑分布上的高分辨率，尤其對(duì)于粒徑主體分布小于1um的樣品，可觀(guān)測(cè)到尾端粒子的復(fù)雜分布情況。如前所述，Accusizer780顆粒計(jì)數(shù)器不僅能得到樣品的粒徑分布，還能做到顆粒計(jì)數(shù)。

本文采用配有自動(dòng)稀釋功能的Accusizer780進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用來(lái)測(cè)試一種新儀器的效率，該儀器可將血細(xì)胞的主要成分進(jìn)行分離。在大多數(shù)醫(yī)院，血細(xì)胞都是用電阻法進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)分析。電阻顆粒計(jì)數(shù)器由兩個(gè)電極，電解質(zhì)鹽溶液，一個(gè)帶有小孔的非導(dǎo)電玻璃罩組成，電荷可從一個(gè)電極流向另一個(gè)電極。血液樣品注入樣品池的一端后，由于玻璃小孔一端的壓力差不同，液體會(huì)流經(jīng)小孔，從而導(dǎo)致電極間的電荷流動(dòng)，相應(yīng)的電流會(huì)發(fā)生變化，或維持電流不變，電壓增加，電壓或電流的響應(yīng)值與樣品池的排除體積成比例。通過(guò)這種方法，可確定血細(xì)胞的粒徑分布和顆粒濃度。

電阻法有以下缺陷：① 電阻法要求樣品懸浮在高導(dǎo)電率的分散劑中，這大大增加了操作成本；② 玻璃小孔很容易堵塞；③ 小孔的規(guī)格很小，會(huì)限制樣品的流經(jīng)速度，從而限制粒子的計(jì)數(shù)速率，以上這些因素都限制了電阻法測(cè)試血細(xì)胞的粒度分布和計(jì)數(shù)的使用。Accusizer780則沒(méi)有以上問(wèn)題存在，該技術(shù)基于光阻法的原理，任何合適的稀釋劑都可使用。這一點(diǎn)對(duì)于血細(xì)胞分離裝置很重要，因?yàn)樗枰喾N不同的緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)不同程度的分離，而其他離子的存在會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生不利影響。Accusizer780的樣品流動(dòng)池與紅細(xì)胞和白細(xì)胞(凝塊及其他大的凝聚物)的大小相比，流動(dòng)池的尺寸很大，因此很少發(fā)生堵塞。重要的是，儀器的稀釋速度可高達(dá)120ml/min，對(duì)于來(lái)自分離器的高濃度血液成分，可做到快速的自動(dòng)稀釋以及顆粒計(jì)數(shù)。

該實(shí)驗(yàn)測(cè)試的樣品為血細(xì)胞，范圍從紅細(xì)胞居多的成分到白細(xì)胞居多的成分，總共分析了六個(gè)組分，命名從4到9。在“AN160”文獻(xiàn)中，通過(guò)對(duì)樣品4的zeta電位的檢測(cè)可確定，樣品4中幾乎是紅細(xì)胞，而5~9號(hào)樣品則分別含有越來(lái)越多的白細(xì)胞。

圖1顯示了Accusizer780測(cè)試不同樣品的粒徑分布圖：

 圖1：不同組分的血液樣品疊加圖

除4號(hào)樣品外，其他樣品的粒徑分布均由兩個(gè)窄峰組成。首峰的粒徑在8.5um左右，是紅細(xì)胞的粒徑大小，第二個(gè)峰粒徑分布在11-12um左右，與白細(xì)胞的粒徑大小匹配，所以可識(shí)別紅細(xì)胞（首峰）和白細(xì)胞（第二個(gè)峰）的粒度分布及濃度占比。需注意的是，在圖1中，第二個(gè)峰的濃度分布在樣品4中幾乎為0，但后續(xù)幾個(gè)樣品中數(shù)目越來(lái)越大。首先，這說(shuō)明樣品4實(shí)際上是紅細(xì)胞，其次這一數(shù)據(jù)還表明，其他樣品中的白細(xì)胞組分變得更加豐富。圖2繪制了白細(xì)胞與紅細(xì)胞的體積和計(jì)數(shù)的比率圖。

圖2：a. 紅細(xì)胞與白細(xì)胞的體積占比圖  b. 紅細(xì)胞與白細(xì)胞的數(shù)目占比圖

圖2a為峰2與峰1的體積占比，圖2b為峰2與峰1的數(shù)目占比，這些數(shù)據(jù)可表明血液分離裝置將紅細(xì)胞和白細(xì)胞分離的程度大小。值得一提的是，樣品4中的紅細(xì)胞與白細(xì)胞的數(shù)目占比約為500:1（圖中顯示為0.002），但樣品5-9中，占比在逐漸增加（樣品9的比率接近0.3，約是正常值的100倍），這進(jìn)一步說(shuō)明了分離裝置的效率。這一數(shù)據(jù)還表明，Accusizer780可以用于定量測(cè)量樣品中紅血球和白細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。

若使用電阻法測(cè)試白細(xì)胞數(shù)量，則在測(cè)試前須先溶解（破壞）紅細(xì)胞，因?yàn)榧t細(xì)胞的數(shù)量往往會(huì)使白細(xì)胞的計(jì)數(shù)變得更困難及不。*，溶解會(huì)對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞造成影響，使得紅細(xì)胞幾乎被破壞，而白細(xì)胞的細(xì)胞膜則被剝?nèi)ゲF(tuán)聚在一起，形成不同的顆粒。圖3測(cè)試了樣品6在溶解后的粒度分布，在6-7um處出現(xiàn)一個(gè)單峰，且顆粒數(shù)目大大減少。根據(jù)我們已知的化學(xué)溶解效應(yīng)，圖3中的分布粒徑是白細(xì)胞溶解后的殘留，而實(shí)際存在的第二個(gè)窄峰在溶解后就消失了。

綜上所述，本文提供的數(shù)據(jù)表明，SPOS可以同時(shí)測(cè)試紅血球和白細(xì)胞的粒徑分布和顆粒濃度。此外，還可配置自動(dòng)稀釋模塊對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)稀釋?zhuān)眠@種方法可在不溶解紅細(xì)胞的前提下，對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行定量分析。研究表明，溶解會(huì)破壞紅細(xì)胞，但只會(huì)將白細(xì)胞的粒徑大小從12um降低到6.5um左右。